期刊信息
主办:中国动物学会;中国科学院动物研究所
主管:中国科学院
ISSN:0250-3263
CN:11-1830/Q
语言:中文
周期:双月
影响因子:0.467105
数据库收录:
文摘杂志;北大核心期刊(1992版);北大核心期刊(1996版);北大核心期刊(2000版);北大核心期刊(2004版);北大核心期刊(2008版);北大核心期刊(2011版);北大核心期刊(2014版);北大核心期刊(2017版);农业与生物科学研究中心文摘;化学文摘(网络版);中国科学引文数据库(2011-2012);中国科学引文数据库(2013-2014);中国科学引文数据库(2015-2016);中国科学引文数据库(2017-2018);中国科学引文数据库(2019-2020);日本科学技术振兴机构数据库;中国科技核心期刊;期刊分类:生物学
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研究报告
猪圆环病毒型探针法实时荧光定量检测方法的建(2)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】1.2.5 实时荧光定量 PCR敏感性试验 将 pSL1353质粒稀释成 1 000×106,100×106,50×106,20×106, 5×106和 106拷贝·L-1, 设置 6 重复·浓度-1, 测定各浓度下的循环
1.2.5 实时荧光定量 PCR敏感性试验 将 pSL1353质粒稀释成 1 000×106,100×106,50×106,20×106, 5×106和 106拷贝·L-1, 设置 6 重复·浓度-1, 测定各浓度下的循环数(Ct), 用 PODLOD calculation program(version 8)[9]计算本检测方法的最低检测限值。
1.2.6 实时荧光定量PCR重复性试验 以空白模板对照,检测已知的PCV2 DNA样品,间隔1周做重复试验, 重复 3 次·样品-1(组间); 检测已知的 3 个 PCV2 DNA 样品(1013, 1012, 1011拷贝·L-1), 重复 6个·样品-1(组内)。 计算组内和组间变异系数(CV),验证该方法的重复性。其中SCt为Ct的标准差,为Ct的平均值。
1.2.7 实时荧光定量PCR特异性试验 以1.2.3建立的PCV2 Taqman探针实时荧光定量方法同时对CSFV,PRRSV,PEDV/TGEV/RV进行检测,以空白模板为对照,确定该方法的特异性。
1.2.8 临床样品的检测 以1.2.3建立的PCV2 Taqman探针实时荧光定量方法检测2016-2017年杭州市周边地区规模化生猪养殖场送检的50份疑似病料(腹股沟淋巴结)。
2 结果与分析
2.1 PCV2阳性标准品的制备
以PCV2疫苗毒株所提取的DNA为模板,利用特异性引物(ORF1-F/R)扩增出大小约100 bp的片段;扩增产物回收后借助T/A克隆技术,构建pMD18-T-PCV2-ORF1载体(pSL1353),经菌落PCR和质粒PCR鉴定为阳性克隆(图1)。测序验证其序列,发现与NCBI上PCV2的序列(GenBank:KY.1)同源性达 100%。提取pSL1353质粒作为本研究方法的阳性质控,可以作为判断试验成立与否的阳性模板。
2.2 实时荧光定量PCR反应体系及反应程序的优化
依据1.2.3,发现退火温度为60℃时扩增效率最高。在PCV2质粒浓度1013拷贝·L-1时进行反应条件优化,根据有典型扩增曲线且Ct值最小的原则, 发现上、 下游引物浓度 0.2 μmol·L-1(图 2A)和探针浓度 0.2 μmol·L-1(图 2B)时扩增效果最佳。 该结果可作为试剂盒开发及成本控制的理论依据。
图1 阳性标准质粒的PCR鉴定Figure 1 Identification of positive standard plasmids by PCR
2.3 实时荧光定量PCR标准曲线的建立
将稀释(1013, 1012, 1011, 1010, 109, 108, 107, 106拷贝·L-1)后的重组质粒作为模板, 在 2.2 的 Taqman探针实时荧光定量PCR优化条件下进行扩增(图3A),得到标准曲线如图3B所示,其线性回归方程为Ct=-0.671 4×lgA+38.16,其中A为模板浓度。相关系数(R2)为0.974 5,表明本研究所建立的方法在模板为2.1×1013~2.1×106拷贝·L-1时,检测到Ct值和模板之间具有较好的线性关系。
2.4 实时荧光定量PCR的重复性
选取2.3中1013,1012,1011拷贝·L-1阳性质粒为模板,在2.2优化条件下进行重复试验。结果表明:组内样品扩增曲线重复性较好(图4),组内与组间Ct值的变异系数较小(表1),表明该检测方法有较好的重复性。
图2 反应体系和反应条件的优化Figure 2 Optimized system and conditions of reaction of PCV2
图3 实时荧光定量PCR标准曲线的建立Figure 3 Standard curve of the real-time quantitative PCR of PCV2
2.5 实时荧光定量PCR的灵敏性
阳性标准质粒 pSL353分别按照 1 000×106,100×106, 50×106, 20×106, 5×106和 106拷贝·L-1, 重复 6 次·浓度-1,进行实时荧光定量 PCR扩增,有典型的扩增曲线且Ct值小于38时判断为阳性。结果表明:每个浓度均具有较好的重复(图5)。PODLOD V8软件[9]公式计算,得到该方法的最低检测线为 8.828×106拷贝·L-1(95%的检测限)(表 2)。
图4 PCV2实时荧光定量PCR重复性试验扩增曲线Figure 4 Amplification curve of repetitive assay PCV2
2.6 实时荧光定量PCR的特异性
分别以 PCV2的基因组 DNA,PEDV,TGEV,PEDV/TGEV/RV三联疫苗的cDNA为模板,利用1.2.3构建的检测方法进行实时荧光定量PCR扩增。结果表明:PCV2病毒组有特征性扩增曲线,其他各组则没有,说明该方法具有较好的特异性(图6),为临床疾病混合感染情况下准确检测PCV2提供了工具。
表1 实时荧光定量PCR的重复性验证Table 1 Repetitive assay of the real-time quantitative PCR质粒浓度/(拷贝·L-1)CV/%组内 组间1 0130.2 8 0.3 4 1 0120.1 4 0.3 2 1 0110.0 9 0.2 8
2.7 临床样品的检测
以实验室收集到的2016-2017年杭州市周边地区规模化生猪养殖场的50份PCV2疑似病料(腹股沟淋巴结)为检测样本,提取样本中的DNA,利用本研究的PCV2实时荧光定量PCR检测方法进行检测。结果表明:送检50份样品中该方法检出40份阳性,待检样品的PCV2阳性率达80%(表3),与普通PCR检测结果基本一致。
文章来源:《动物学杂志》 网址: http://www.dwxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0708/638.html
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